Autofluorescencja komórek w ocenie neoplazji szyjki macicy

Luis Burke, MD, * Jonathan Niloff, MD, * Marc Kobelin, MD, * Graziella Abu-Jawdeh, MD AIex Zelenchuk, P hD, i Mark Modell, MS-Departments of *Obstetrics, Gynecology and Reproductive Biology, and Pathology. Hartvard Medical School and Beth Israel Hospital, Boston, and J MediASpectra Inc., Cambridge. Massachusetts, Stany Zjednoczone. Tłumaczył Andrzej Nienartowicz

Streszczenie

Cel. Wykorzystanie zjawiska fluorescencji tkanek podczas kolposkopowego wykrywania różnego stopnia wewnątrznabłonkowych zmian płaskonabłonkowych (SIL=Squamous Intraepithelial Lesions) w szyjce macicy. Tkanki poddane odpowiedniemu oświetleniu fluoryzują. Pewne wcześniejsze obserwacje sugerują, iż fluorescencja komórek rakowych jest inna niż komórek zdrowych. To właśnie zjawisko starano się wykorzystać w niniejszej pracy.

Metody. W celu zmierzenia fluorescencji opracowano specjalną sondę (Colpoprobe, MediSpectra, Cambridge, MA). Została ona skonstruowana do bezstykowych pomiarów spektrofotometrycznych. Głowicę optyczną instrumentu przymocowuje się do standardowego kolposkopu. W celu opracowania modelu wzorcowego wykonano pomiary in vivo u pacjentek z rozpoznanymi nieprawidłowymi obrazami cytologicznymi. Uzyskano obrazy spektralne z 65 miejsc od 36 pacjentek.

Wyniki. W analizowanym materiale uzyskano 38 obrazów odpowiadających współistnieniu stanu prawidłowego i zmian łagodnych oraz 27 obrazów odpowiadających SIL. Przy użyciu algorytmu opracowanego dla wzorcowego zestawu obrazów, wyliczono czułość i swoistość, która wynosiła odpowiednio 96 i 71 %. Pozytywna wartość predykcyjna wyniosła 71 % a negatywna wartość predykcyjna 93%.

Wniosek. Wstępne obserwacje wskazują że metoda ta może być użyteczna w procesie diagnostycznym.

Fluorescencja wiąże się z emisją promieniowania elektromagnetycznego danej substancji będącą reakcją na absorpcję energii ze źródła światła. Fluorescencja tkanki jest wynikiem nakładania się fluorescencji wielu cząsteczek tej tkanki. Obserwowane widma fluorescencji także zależą od absorpcji i rozproszenia światła wzbudzającego oraz od tkankowej emisji fluorescencji ¹ .

Kiedy tkankę biologiczną oświetla się odpowiednią barwą światła, to większość jej elementów, zarówno tych które tworzą strukturę tkankową, jak i te które odpowiedzialne są za intensywność przemian metabolicznych, daje fluorescencję w szerokim zakresie widma – od ultrafioletu (DV) do światła widzialnego. Ponieważ emisja fluorescencji jest ściśle zależna od biochemicznych i fizykochemicznych właściwości oświetlonej próbki, to na podstawie ich właściwości spektralnych można różnicować tkanki o różnym stanie morfologicznym i czynnościowym. Głównymi składnikami tkankowymi odpowiedzialnymi za fluorescencję są: kolagen, zredukowana forma amidu kwasu nikotynowego, dwunukleotyd adeniny (NADH) oraz dwunukleotyd flawinoadeniny. Naświetlenie ultrafioletem aktywuje wiele znanych fluoroforów tkankowych, wliczając w to tyrozynę, tryptofan, kolagen, pirymidynę, elastynę, NADH, porfiryny i flawiny.

Chociaż odnośne mechanizmy nie zostały dotąd jasno określone, to jednak fluorescencyjny obraz nowotworu wydaje się odzwierciedlać zarówno jego stan biochemiczny, jak i morfologiczny. Obserwowane zmiany spektralne są podobne w wielu rakach śluzowych, co sugeruje aktywację podobnych mechanizmów. Na przykład, pewne typowe cechy widma autofluorescencji mogą odpowiadać biochemicznym zmianom aktywności mitochondriów (np. we względnym stężeniu NADH i flawin). Pogrubienie kolagenu oraz zmiany we włośniczkowej są zjawiskami strukturalnymi, które również mogą wywołać typowe zmiany w obrazie spektroskopowym. Ponieważ nowotwory mają grubszą błonę śluzową niż tkanki prawidłowe, odbierany będzie słabszy sygnał z kolagenu podśluzówkowego. Ponadto, nowotwory są bardziej unaczynione niż tkanki prawidłowe. Hemoglobina wykazuje tendencję do zmniejszania podśluzówkowego sygnału fluorescencyjnego. Ponieważ tory metaboliczne komórek nowotworów złośliwych to głównie mechanizmy beztlenowe, sądzi się, iż wykazują one wyższy poziom NADH. Jego fluorescencja może pozwolić na odróżnianie komórek rakowych.

Sonda spektralna kolposkopowa

W MediSpectra (Cambridge, MA), przy współpracy z oddziałem onkologii ginekologicznej bostońskiego szpitala Beth Israel, opracowano przyrząd do pomiaru autofluorescencji w tkankach ludzkich. Przyrząd ten, nazwany Colpoprobe, jest przeznaczony do bezstykowych pomiarów spektrofotometrycznych. Przyrząd bada tkankę szyjki macicy, mierząc i przetwarzając sygnał autofluorescencyjny i wsteczne rozproszenie widma tkanki poddanej właściwemu oświetleniu. Przyrząd składa się z głowicy optycznej, źródeł widma, części pomiarowej widma, komputera nadzorującego oraz z oprogramowania analitycznego.

Głowicę optyczną mocuje się do standardowego kolposkopu od strony pacjentki (ryc. 1). Konstrukcja głowicy zezwala na zamontowanie jej z dowolnej strony, zależnie od upodobań badającego, nie utrudnia ona możliwości manewrowania takimi przyrządami, jak np. szczypczyki biopsyjne. Głowica jest połączona z pozostałą częścią kolposkopu za pomocą przewodu optycznego.

W układzie optycznym pomiędzy przyrządem a kolposkopem znajduje się lusterko celownicze, selektywne dla długości fali, sterowane drążkiem manipulacyjnym. Lusterko nie blokuje pola widzenia, tak więc nie przeszkadza podczas obserwacji kolposkopowej. Po uruchomieniu przyrządu, może on pracować w trybie celowania lub w trybie pomiarowym (wybór opcji przyciskiem). Drążek manipulacyjny umożliwia badającemu wybranie reprezentatywnych punktów w zakresie pola widzenia kolposkopu, używając przy tym wysyłanej przez sondę znacznikowej wiązki światła. W trybie celowania, manipulując drążkiem przesuwa się po tarczy części pochwowej znacznikowy punkt świetlny. Wycelowany przyrząd zostaje zablokowany do wykonania pomiarów. Wybrane miejsce do biopsji pozostaje nadal oświetlone światłem celownika. Do wysyłania impulsu na tarczę szyjki macicy używa się czterech kanałów optycznych (ryc. 2). Kanał oświetlający normalnie przewodzi światło z wewnętrznego źródła oświetlenia kolposkopu do szyjki macicy, a obraz tarczy wraca z powrotem do kolposkopu, nie oddziałując przy tym na badającego. W kanale światła białego, do mierzenia rozproszenia wstecznego widma, zostaje zastosowane szerokopasmowe źródło światła o temp. 5300K. Czerwony kanał, 635 nm, jest kanałem celowania, nadaje on sygnał znacznikowy. Kanał UV, 337 nm jest używany do wzbudzania fluorescencji oraz do . mierzenia rozproszenia wstecznego. W związku ze stosowaniem szerokich pasm widma w układzie optycznym nie zastosowano żadnego elementu załamującego fale; tym samym uniknięto trudności z wtórnym widmem, towarzyszącym zastosowaniu skupiającego elementu załamującego.

Badania wstępne

W celu opracowania wzorców widm, wykonano badania in vivo u pacjentek skierowanych na badania kolposkopowe z powodu nieprawidłowych wymazów cytologicznych. Wszystkie pacjentki były w wieku poniżej 50 lat i nie były w ciąży. Wyłączono z badań kobiety z wywiadem obciążonym ekspozycją in utero na dietylstilbestrol. Przed procedurą poinformowano o niej pacjentki i uzyskano ich pisemną zgodę.

Technika badania

Przed każdym badaniem, sondę kalibrowano za pomocą standardowego obiektu fluorescencyjnego. Obraz spektrum wzorcowego obiektu, jak również odczyty detektora, były zapisywane. Następnie przeprowadzano badanie kolposkopowe. Po uwidocznieniu zmiany, dokonywano pomiarów fluorescencji z tego miejsca. Drugie pomiary wykonywano po zastosowaniu 3% kwasu octowego na miejsce badane. Wykonywano biopsję z odpowiednich miejsc zmiany. Z obszaru, który był kolposkopowo oceniony jako prawidłowy, zbierano podobne pomiary i wykonano biopsje. Obraz widma analizowano komputerowo aż do znalezienia optymalnej oceny (ryc. 3). Zmiany patologiczne tkanki klasyfikowano zgodnie z systemem Bethesda. Wstępną analizę dyskryminacyjną ukierunkowano na odróżnienie SIL niskiego stopnia (LSIL) (wewnątrznabłonkowa neoplazja szyjki macicy GIN 1 / zakażenie ludzkim wirusem Papilloma (HPV)), uszkodzeń wysokiego stopnia SIL (HSIL) (GIN 2/CIN 3) oraz inwazyjnego raka szyjki macicy od łagodnych zmian patologicznych (zapalenia, obszary przekształceń i obrazy prawidłowe).

Wyniki wstępne

Analizie poddano obrazy widmowe pochodzące z 65 miejsc u 36 pacjentek. Spośród tych 65 miejsc, 27 zdiagnozowano histologicznie jako miejsca nie objęte procesem chorobowym, 11 jako strefy przekształceń, 16 jako LSIL, a 11 jako HSIL. Tak więc, łącznie stwierdzono 38 miejsc zdrowych lub ze zmianami łagodnymi, oraz 27 punktów wykazujących uszkodzenie nabłonka wielowarstwowego – SIL. Przy użyciu algorytmu opracowanego dla treningowego zestawu danych, wyliczona czułość i swoistość wynosiła odpowiednio 96 i 71 %. Pozytywna wartość predykcyjna wynosiła 71%, a negatywna wartość predykcyjna 93% (tab. 1).

Dyskusja

W licznych badaniach wykazano potencjalną możliwość wykorzystania fluorescencji do rozpoznania nowotworów w różnych układach narządowych ² . W ostatnio opublikowanym badaniu, oceniającym fluorescencję nowotworów szyjki macicy ³ , inny zespół badaczy oceniał kolposkopowo prawidłowe, a histologicznie nieprawidłowe miejsca u 28 pacjentek.

Zastosowana przez nich technika różniła się od naszej tym, że przez wziernik pochwowy pod kontrolą kolposkopu głęboko wprowadzano ogniskującą sondę kontaktową zbudowaną z wielu włókien optycznych. Nasza metoda jest techniką bez kontaktową. Badacze donieśli o odróżnianiu prawidłowych tkanek od zapalenia, od infekcji HPV, jak również od CIN. Stwierdzona pozytywna wartość predykcyjna wynosiła 92% dla prawidłowych tkanek, 90% dla zapaleń i HPV oraz 88% dla CIN. W odróżnianiu zapaleń, HPV od CIN wartość predykcyjna wynosiła 87% dla zapaleń, 73% dla HPV i 74% dla CIN. Bezpośrednie porównanie tych wyników z naszymi nie jest możliwe z powodu użycia różnych sposobów oceny zmian tkankowych. Niemniej jednak, uzyskane wyniki są podobne. Warto zanotować, iż nasze wyniki są także porównywalne z wynikami badań kolposkopowych i biopsji punktowych ⁴ .

Wziąwszy pod uwagę zachęcające wstępne dane, planujemy dokonanie oceny tej metody w większej grupie pacjentek, aby określić, czy ta technika może być pomocna w wyborze miejsca do biopsji wykonywanej pod kontrolą kolposkopu oraz, czy może mieć zastosowanie jako narzędzie diagnostyczne.

Piśmiennictwo