Infekcja wirusem brodawczaka ludzkiego i zmiany struktury genu p53 w raku sromu

Hyo-Pyo Lee, MD*, Chang-Soo Park, MD*, Yong-Sang Song, MD*, In-Ae Park, MD#, Soon-Beom Kang, MD* from * the Departments of Obstetrics and Gynecology and # Pathology, Seoul National University Hospital, Seoul, Korea. Tlumaczyła Lidia Martyńska

Abstrakt

Cel: W ostatnich doniesieniach sugerowano związek między zakażeniem wirusem brodawczaka ludzkiego (human papillomavirus – HPV) a rakiem sromu oraz wskazano na to, że dla powstania i rozwoju tej choroby istotne znaczenie ma zmiana struktury genu p53. Celem tych badań była analiza zależności pomiędzy infekcją wirusem HPV i zmianami w genie p53, w patogenezie raka sromu.

Metody: Od 21 pacjentek ze stanem przedrakowym lub rakiem sromu pobrano wycinki tkanek i zatopiono je w parafinie. Występowanie sekwencji DNA wirusa HPV wykrywano za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (polymerase chain reaction – PGR) i Southern blottingu (technika hybrydyzacji DNA zastosowana po raz pierwszy przez E. Southerna – przyp. red). Zmiany aktywności genu p53 wykrywano metodami immunohistochemicznymi przy użyciu monoklonalnych przeciwciał przeciwko białku p53 (monoclonal antibody DO7 – MAb DO7), a mutacje w jego obrębie ocenione zostały poprzez analizę typu PCR-SSCP (single-strand conformation polymorphism – wielopostaciowość struktury pojedynczej nici) oraz bezpośrednie określenie sekwencji nukleotydów produktów otrzymanych w tej reakcji.

Wyniki: Sekwencja DNA wirusa brodawczaka ludzkiego typu 16 została wykryta w 8 z 15 wycinków tkanek pobranych z nowotworu płaskonabłonkowego sromu (53, 3%), a w 10 z 15 wycinków (66, 7%) metodami immunohistochemicznymi stwierdzono zmiany w genie p53. Trzy z tych 10 próbek, które wykazywały immunohistochemicznie nadekspresję genu p53, miały mutacje punktowe w egzonie 7 genu p53. We wszystkich przypadkach raka, w których nie wykazano obecności wirusa brodawczaka ludzkiego (raka HPV-negatywnego), stwierdzono zmiany w genie p53, podczas gdy w przypadkach raka HPV-pozytywnego stwierdzono je tylko w 3 z 8 przypadków (37, 5%). Wykazano istotną statystycznie odwrotną zależność między zakażeniem wirusem HPV i zmianami w genie p53.

Wnioski: Uzyskane wyniki sugerują, że zakażenie wirusem HPV i zmiany genu p53 są istotne w rozwoju raka płaskonabłonkowego sromu oraz, że rak płaskonabłonkowy sromu może być traktowany jako dwie różne jednoski chorobowe.

Rak sromu jest rzadko spotykaną chorobą starszych kobiet, a jego etiologia nie jest całkowicie poznana. Badania epidemiologiczne wykazują, że czynniki ryzyka jego wystąpienia są podobne do czynników ryzyka innych nowotworów układu płciowego, szczególnie raka szyjki macicy. ^1,3 Ponieważ występowanie raka płaskonabłonkowego szyjki i śródnabłonkowego raka szyjki (cervical intraepithelial neoplasia – CIN) jednoznacznie powiązano z wirusem HPV, sugerowano również związek tego wirusa z rozwojem raka sromu. Wirus HPV uważany jest za główny czynnik powodujący powstawanie raka szyjki macicy, w którym stopień jego wykrywalności sięga 90% (4-6). Najczęściej występującymi typami wirusa HPV są typ 16 i typ 18. Chociaż w inwazyjnym raku sromu (vulvular intraepithelial neoplasia – VIN) obecność wirusa brodawczaka HPV wykrywana jest prawie w tym samym stopniu, to jego obecność stwierdzono tylko w 15-50% przypadków inwazyjnego raka sromu bez istnienia ognisk raka śródnabłonkowego (VIN) ^{(7, 8)} . Sugeruje się, że rak płaskonabłonkowy sromu można traktować jako dwie różne jednostki chorobowe. Wydaje się, że pacjentki z rakiem sromu powiązanym z zakażeniem wirusem HPV należą do młodszej grupy wiekowej. Stwierdzono u nich wieloogniskowe ubytki w nabłonku, podczas gdy większość raków sromu u kobiet starszych nie była związana z obecnością wirusa HPV. ^{(4, 7, 8)}

Mutacje genu p53 są najbardziej powszechną zmianą genetyczną w różnych rodzajach nowotworów występujących u ludzi ⁽⁹⁾ . Białko p53 jest fosfoproteiną występującą w jądrze komórkowym, które działa jak gen hamujący transformację nowotworową, prawdopodobnie poprzez kontrolowanie proliferacji komórek ⁽¹⁰⁾ . Wirus brodawczaka ludzkiego koduje dwa białka transformacyjne: E6 i E7. Działanie tych białek może polegać na ich interakcji z genami hamującymi rozwój nowotworu ⁽¹¹⁾ . Inaktywacja p53 w przypadku raka sromu może teoretycznie powstawać na drodze dwóch mechanizmów: (1) zakażenie komórek nabłonka przez onkogenny HPV może powodować utratę funkcji białka p53 wywołaną przez wirusowe białko E6, albo (2) mutacje genu p53 mogą powodować jego dysfunkcję w nieobecności wirusa HPV. Jednak niewiele prac było poświęconych analizie związków między zakażeniem wirusem HPV, a mutacjami genu p53 w przypadkach raka sromu. W prezentowanej pracy, aby określić zależność między tymi czynnikami, badano częstość występowania zarażenia wirusem HPV i mutacji genu p53.

Materiał i metody

Dobór pacjentek

Wybrano dwadzieścia jeden pacjentek ze zmianami przedrakowymi i rakiem inwazyjnym sromu po operacjach przeprowadzonych w Oddziale Położnictwa i Ginekologii w Narodowym Szpitalu Uniwersyteckim w Seulu od lutego 1980 do czerwca 1994 r. Posługiwano się rejestrem chorych z nowotworami i badano ich historie chorób. Jako materiałem posłużono się zatopionymi w parafinie wycinkami tkanek pobranymi podczas operacji: 15 nowotworów płaskonabłonkowych sromu, 2 gruczolakoraków (adenoid cysticcarcinoma), 2 przypadków VIN i 2 przypadków choroby Pageta. Parafinowe skrawki tkanki wybarwiono hematoksyliną i eozyną a następnie poddano ponownej ocenie histopatologicznej. Do dalszych badań wybrano takie, które wykazywały najwięcej tkanki nowotworowej i możliwie najmniejszą ilością zmian martwiczych. Z każdego wycinka pobrano 50 mcm skrawki do reakcji PGR i 5 mcm skrawki do barwienia immunohistochemicznego. Charakter zmian badany był w zestawieniu z badaniami klinicznymi -wiekiem pacjentki, stopniem zaawansowania choroby i rodzajem zastosowanego leczenia.

Przygotowanie próbek do badań

Wyizolowanie DNA z zatopionych w parafinie skrawków tkanek przeprowadzono metodą opisaną przez Wrighta i Manosa ⁽¹²⁾ . 50 mcm skrawek tkanki umieszczano w 1, 5-ml probówce z polipropylenu i odparafinowywano przez 30 min w ksylenie w temp. 37°C, dwukrotnie odwirowywano przy 6000 obr/min przez 3 min, dwukrotnie płukano w 1 ml alkoholu absolutnego przez 30 min i suszono powietrzem. Próbkę następnie trawiono w 100 ml buforu zawierającego: 10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, 0, 5% Tween 20 i 5 ml Proteinazy-K (2 mg/ml). Po 2 godzinnej inkubacji w temp. 50°C i 5 minutach w temp. 95°C, w celu inaktywacji proteazy, próbkę krótko odwirowywano i supernatant, do późniejszych badań PGR, zamrażano w temp. -20°C.

Powielanie DNA techniką pgr (reakcji łańcuchowej polimerazy).

Po dodaniu 10 mcl supernatantu do 90 mci roztworu buforu reakcyjnego PGR uzyskano objętość całkowitą 100 mcl zawierającą: 100 mcM każdego z czterech trójfosforanów nukleotydów, 20 mM Tris-HCI (pH 8, 3), 1, 5 mM MgCI 2 , 25 mM KCI, 0, 05% Tween 20 i 1jm polimerazy Taq. Mieszanina reakcyjna zawierała także 0, 25 mcM par syntetycznych starterów, specyficznych dla obszaru 120 par zasad (bp) genomu wirusa HPVtypu 16 i obszaru 100 bp wirusa HPV typu 18. Do każdej próbki dodano również 0, 5 mcM starterów beta-globiny dla zapewnienia kontroli wewnętrznej. Startery dostarczone były przez Clontech (Palo Alto, Kalifornia, Stany Zjednoczone). Do PCR użyto starterów oligonukleotydowych o następujących sekwencjach:

HPV 16      U, 5' – TCAAAAGCCACTGTGTCCTG – 3'                                                                                                                                                                                                                                                                           D, 5' -ACCTTAATGAAAAACGACGA- 3'

HPV 18      U, 5' – CGTGTTCTTGATGATCTGCA – 3'                                                                                                                                                                                                                                                        D, 5' – CGTCGTTGGAGTCGTTCCTG – 3'                                                                                                                                                                                                                                                               Odpowiednio zaznaczono startery: U – w górę nici i D – w dół nici.

Próbki pokryto kroplami oleju mineralnego, aby zapobiec ich wysychaniu, a następnie umieszczono w termocyklerze DNA (urządzeniu do przeprowadzenia reakcji PCR – przyp. red. ) (Hybaid thermal reactor, Hybaid, Wielka Brytania) na 35 cykli powielania. Każdy cykl składał się z etapu denaturacji przebiegającego w temp. 96°C trwającego 60 s, etapu asocjacji starterów z matrycą w temp. 56°C przez 60 s i okresu wydłużania starterów (polimeryzacji DNA) w temp. 72°C, trwającego 120 s. W pierwszym cyklu etap denaturacji został przedłużony do 5 minut przy temp. 96°C, również w ostatnim cyklu etap polimeryzacji DNA został przedłużony do 5 minut w temp. 72°C.

ELEKTROFOREZA l BARWIENIE DNA

10 mcl każdej mieszaniny PCR naniesiono na 8% żel poliakrylamidowy i przeprowadzono elektroforezę. Żel barwiono przez 30 minut roztworem bromku etydyny 1 mcl / 1 mcl, efekt obserwowano w świetle ultrafioletowym, oraz fotografowano na czarno-białym filmie polaroidowym (ASA 3000).

Hybrydyzacja metodą southerna

Po powieleniu techniką PCR, DNA wirusa HPV poddane zostało hybrydyzacji metodą Southerna. Po denaturacji żelu poliakrylamidowego w 0, 3 M roztworze NaOH przez 5 min, elektroforetycznie rozdzielone próbki DNA przeniesiono w polu elektrycznym na filtr Hybond-N+ (Zeta Próbę, Amersham, USA) w 0, 5 x rozcieńczonym roztworzeTBE. Następnie utrwalono je w 0, 4 M roztworze NaOH i hybrydyzowano z sondami oznakowanymi DIG na 3'końcu (BM Biochemica, Niemcy), specyficznymi dla wirusa HPV typu 16 i typu 18 (Clontech), w temp. 60°C przez 12 godzin. Sondy oligonukleotydowe miały następujące sekwencje:

HPV16, 5'GACAAAAAGCAAAGATTCCATAATATAAGG GGTCGGTGGA-3 ¹

HPV 18, 5'TACCTGGGCACTATAGAGGCCAGTGCC ATTCGTGCTGCAA-3'

Zabarwienie uzyskano immunologicznie, przy użyciu zestawu do wykrywania kwasów nukleinowych znakowanych DIG (BM Biochemica).

Immunohistochemiczne barwienie genu P53

Skrawki materiału o grubości 5 mcm, utrwalonego w formalinie i zatopionego w parafinie przyklejono do szkiełek powleczonych poli-L-lizyną i odparafinowano w czterech zmianach roztworu ksylolu. Zahamowanie aktywności endogennej peroksydazy uzyskano poprzez 45 – minutową inkubację skrawków w 0, 3% metanolowym roztworze nadtlenku wodoru, a następnie dwukrotnie płukano w buforowanej fosforanami soli fizjologicznej (PBS). W celu zablokowania niespecyficznego wiązania na skrawki naniesiono na 30 min normalną surowicę końską w rozcieńczeniu 1: 20. Następnie skrawki inkubowano z pierwszym przeciwciałem (monoklonalne przeciwciała myszy, D07, Dako, Kalifornia, Stany Zjednoczone) przez 60 min i po tym czasie trzykrotnie płukano w PBS. Inkubacja z drugim przeciwciałem (biotynylowane immunoglobuliny królika przeciwko immunoglobulinom myszy) w rozc. 1: 100 trwała 30 min i ponownie preparaty trzykrotnie płukano w PBS. Skrawki poddano działaniu kompleksu awidyna-biotyna-peroksydaza (Dako LSAB kit, Dako) przez 30 min i płukano w PBS przez 10 min. Reakcję barwną prowadzono 10 min używając, jako substratu dla peroksydazy roztworu zawierającego nadtlenek wodoru i chromogen DAB (3, 3-diaminobenzydyna). Całą procedurę barwienia przeprowadzono w temp. 25°C. Po podbarwieniu skrawków hematoksyliną preparaty zostały ocenione przez trzech patologów. Zabarwienie jądrowego białka p53 klasyfikowano na podstawie procentu liczby komórek p53-pozytywnych jako: ogniskowe + (F+), gdy mniej niż 10% komórek nowotworowych wykazywało reakcję pozytywną; +, gdy takich komórek było 10-50%; ++, gdy liczba ich była wyższa niż 50%. Jako nadmierną ekspresję jądrowego białka p53 określano stan, gdy ponad 10% komórek guza wykazywało dodatnią reakcję w barwieniu imrnunohistochemicznym

ANALIZA TYPU PCR-SSCP (REAKCJA ŁAŃCUCHOWEJ POLIMERAZY-WIELOPOSTACIOWOŚĆ STRUKTURY POJEDYNCZEJ NICI – SINGLE STRAND CONFORMATION POLYMORPHISM)

Egzony 5-8 genu p53 powielono metodą PCR. Oligonukleotydowe startery użyte do powielania były następujące:

egzon 5U    5'-TTCCTCTTCCTGCAGTACTC-3'                                                                                                                                                                                                                                                             egzon 5D   5'-ACCCTGGGCAACCAGCCCTGT-3'                                                                                                                                                                                                                                                 egzon 6U   5'-AGTTGCAAACCAGACCTCAG-3'                                                                                                                                                                                                                                                 egzon 6D    5'-ACAGGGCTGGTTGCCCAGGGG-3'                                                                                                                                                                                                                                           egzon 7U   5'-GTGTTGTCTCCTAGGTTGGC-3'                                                                                                                                                                                                                                                   egzon 7D   5'-GTCAGAGGCAAGCAGAGGCT-3'                                                                                                                                                                                                                                                egzon 8U    5'-TATCCTGAGTAGTGGTAATC-3'                                                                                                                                                                                                                                                              egzon 8D    5'-AAGTGAATCTGAGGCATAAC-3'                                              

Startery oznaczono odpowiednio U – w górę i D – w dół nici.

Reakcje PCR przeprowadzano w 20 mcl mieszaninie reakcyjnej zawierającej: 100 ng wzorcowego DNA, 1, 5 mM MgCI 2 , 0, 5 mcM każdego startera, 125 mcM dNTP (trójfosforanów nukleotydów), 0, 5 mcCi [-P ³² ]dATP (3000 Ci/ mmol) (Ci=Curie -jednostka radioaktywności – przyp. red. ), 1 jm polimerazy Taq (Boehringer Mannheim, Niemcy) i 200 mcg/ml żelatyny. Mieszaniny reakcyjne poddano 35 cyklom powielenia, każdy cykl składał się z etapu denaturacji w temp. 94°C trwającego 1 min, etapu asocjacji starterów z matrycą w temp. 63°C przez 1 min i okresu wydłużania starterów (polimeryzacji DNA) w temp. 72°C trwającego 2 min; próbkę 5 mci produktów reakcji PCR rozcieńczono w 20 mcl 0, 1% NaDodSO 4 /10mM EDTA i połączono w stosunku 1: 1 z odczynnikiem zatrzymującym reakcję, zawierającym 20 mM NaOH. Produkty PCR zdenaturowano w temp. 80°C przez 3 minuty i próbkę 3 mcl tak przygotowanego DNA nałożono na 6% żel poliakrylamidowy zawierający 10% glicerolu. Próbki poddano elektroforezie w temp. 4°C przez 2 do 4 godzin przy użyciu prądu o mocy 50 W. Żele przeniesiono na bibułę Whatmana (3MM), suszono i wykonano autoradiografię na kliszy rentgenowskiej w temp. -70°C przez 12 do 36 godzin.

SEKWENCJONOWANIE PRODUKTÓW PCR

W celu potwierdzenia wyników otrzymanych w analizie techniką PCR-SSCP i określenia zmienionej sekwencji nukleotydów, wykonano bezpośrednie sekwencjonowanie produktów PCR metodą terminacji syntezy łańcucha przez włączanie trójfosforanów dwudezoksyrybonukleotydów. Użyto do tego zestawu sekwencjonującego DNA Cyclist Exo-Pfu (Stratagene, La Jolla, Kalifornia, Stany Zjednoczone) zgodnie z zaleceniami producenta. Zamplifikowane egzony sekwencjonowano z normalnymi próbkami kontrolnymi w obydwu kierunkach, sensownym i antysensownym. Reakcje sekwencjonowania poprzedzono oczyszczeniem i ekstrakcją produktów powielenia przy użyciu Centricon (Amicon, Beverly, MA) zgodnie z instrukcją producenta. 10 mcl mieszaniny reakcyjnej, która zawierała 30 ng starterów, 0, 25 pmol produktów PCR i 5-krotnie rozcieńczony bufor dodawany przez producenta, inkubowano w temp. 70°C przez 5 min. Mieszano 3, 5-mcl próbkę takiej mieszaniny reakcyjnej, 10 mcCi [- ³² P] dATP (3000Ci/mmol), 0, 5 ml oznakowanej mieszaniny reakcyjnej (15 mcl dGTP 0, 5 mM, 15 mcl dCTP 0, 5 mM, 15 mcl dTTP 0, 5 mM, 955 mcl wody destylowanej), 1, 8 mcl TE, 1, 6 mcl wody destylowanej, 1mcl ditiotreitolu, 0, 2 mcl sekwenazy i 2, 5 mcl odczynnika zatrzymującego reakcję i inkubowano w temp. 37°C przez 5 min. Po dodaniu 2 mcl roztworu zatrzymującego reakcję, 5 mci próbkę mieszaniny nałożono na 6% żel poliakrylamidowy z dodatkiem 7 M mocznika i poddano elektroforezie przez 3 godz. prądem o mocy 40 W. Żele były suszone i zrobiono autoradiografię na kliszy rentgenowskiej w temperaturze -70°C przez 3 do 72 godzin.

ANALIZA STATYSTYCZNA

Do oceny zależności między występowaniem wirusa HPV i zmianami w obrębie genu p53, oraz parametrami klinicznymi, takimi jak wiek pacjentek i stopień zaawansowania choroby, zastosowano test Fishera. Analizę statystyczną wyników przeprowadzono przy użyciu komputerowego programu statystycznego SAS (IBM, wersja 6, 04, Cary, Karolina Północna, Stany Zjednoczone) i uważano je za istotne statystycznie, jeśli p < 0, 05.

WYNIKI

OBRAZ KLINICZNY l PATOLOGICZNY ORAZ ANALIZA WYSTĘPOWANIA WIRUSA BRODAWCZAKA LUDZKIEGO

Wiek 15 pacjentek, u których stwierdzono pierwotnego płaskonabłonkowego raka sromu zawierał się między 42 a 81 lat (średnio 61, 9 lat). U trzech pacjentek rak płaskonabłonkowy sromu był związany z występowaniem VIN w przyległym nabłonku. U dwóch pacjentek rak płaskonabłonkowy był typu nierogowaciejącego, a u pozostałych typu rogowaciejącego.

DNA, wyekstrahowane z wycinków tkankowych, poddano analizie na obecność wirusa HPVtypu 16 i typu 18 techniką PCR, przy użyciu specyficznych dla danego typu wirusa starterów. DNA ludzkiego wirusa brodawczaka typu 16 wykryto w jednym z dwóch przypadków gruczolakoraka, we wszystkich przypadkach VIN i w 8 z 15 przypadków (53, 3%) raka płaskonabłonkowego. W żadnym wycinku nie stwierdzono występowania DNA wirusa HPV typu 18. Hybrydyzacja metodą Southerna z sondą dla wirusa HPV typu 16 potwierdziła wyniki PCR, z wyjątkiem jednego przypadku raka płaskonabłonkowego.

EKSPRESJA l ANALIZA GENU P53

Nie stwierdzono nadmiernej ekspresji genu p53 w chorobie Pageta, gruczolakoraku ani w VIN. 10 z 15 przypadków (66, 7%) raka płaskonabłonkowego wykazywało nadekspresję genu p53.

Analizę PCR-SSCP wykonano w celu wykrycia mutacji w egzonach 5-8 genu p53. Nieprawidłową zmianę ruchliwości eletroforetycznej wykryto w 3 z 15 przypadków (20%) raka płaskonabłonkowego. Wszykie trzy przypadki (nr 12, 16, 20) miały nieprawidłowe przesunięcie w egzonie 7 i równocześnie wykazywały silną ekspresję genu p53 (++) w barwieniu immunohistochemicznym. Dwa z nich (nr 12 i 16) były HPV-negatywne, a jeden (nr 20) był pozytywny dla DNA wirusa HPV typu 16.

DNA z trzech wycinków wykazujących nieprawidłowe przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej w analizie PCR-SSCP poddano sekwencjonowaniu. Wszystkie trzy próbki miały mutacje punktowe w obrębie genu p53.

ZALEŻNOŚCI MIĘDZY ZAKAŻENIEM HPV ALBO ZMIANAMI W GENIE P53, A OBRAZEM PATOLOGICZNYM l KLINICZNYM W PŁASKONABŁONKOWYM RAKU SROMU.

Wszystkie trzy przypadki związane z VI N w przylegającym nabłonku (nr 14, 15 i 17) wykazywały obecność wirusa HPV typu 16 i nie wykazywały nadekspresji genu p53 w barwieniu immunocytochemicznym. Jeden (nr 7) z dwóch nowotworów typu nierogowaciejącego był DNA-negatywny dla HPVtypu 16 i DNA-pozytywny dla ekspresji genu p53, ale drugi (nr 14) wykazywał wyniki odwrotne (tab. 1).

Siedem z 10 wycinków od pacjentek w stadium klinicznym l i II (70 %) oraz jeden z 5 wycinków od pacjentek w stadium klinicznym III i IV (20%) zawierało DNA wirusa HPVtypu 16. Sześć z 10 wycinków od pacjentek w klinicznym stadium l i II (60 %) i cztery z 5 wycinków od pacjentek w stadium III i IV (80 %) wykazywało zmiany w genie p53. Stwierdzono jednak brak istotnych statystycznie różnic w zakażeniu wirusem HPV i zmianach genu p53 w zależności od stadium choroby.

Sześć z 8 wycinków od pacjentek z grupy młodszej wiekowo tj. <l- 60 lat (75, 0%) i dwa z 7 wycinków pobranych w grupie starszej wiekowo tj. >60 lat (28, 6%) zawierało DNA wirusa HPV typu 16. Cztery z 8 wycinków z grupy młodszej wiekowo (50%) i sześć z 7 wycinków (85, 7%) z grupy starszej wykazywało zmiany w genie p53. Nie stwierdzono jednak różnic istotnych statystycznie w zakażeniu brodawczakiem HPV i zmianach genu p53 w zależności od wieku pacjentek.

Wszystkie wycinki nie zawierające wirusa HPV typu 16 wykazywały zmiany w genie p53, ale tylko 37, 5% wycinków (3 z 8) pozytywnych dla DNA wirusa HPV typu 16 wykazywało zmiany w p53. Jest to istotna statystycznie odwrotna zależność między infekcją wirusem HPV i zmianami w genie p53 (p < 0, 05).

DYSKUSJA

Rola wirusa HPVw rozwoju raka sromu nie jest jasno określona. Kilka prac wykazało, że rak płaskonabłonkowy sromu dzieli się na dwie jednostki chorobowe, w zależności od infekcji wirusem HPV ^{(13, 14)} . DNA ludzkiego wirusa brodawczaka, szczególnie HPVtypu 16, można znaleźć w 50-90% przypadków zmian patologicznych VIN i

inwazyjnego raka płaskonabłonkowego ze współistniejącym VIN(4-6). W przypadkach większości raków sromu bez współwystępowania VIN, odpowiedni odsetek wynosi tylko 15-50% ^{(4, 7, 8)} . W przedstawianych badaniach dwie pacjentki z VIN i trzy z rakiem płaskonabłonkowym ze współwystępującym VIN w przylegającym nabłonku było DNA-pozytywne dla wirusa HPV typu 16.

Techniką PCR wykryto DNA brodawczka HPV typu 16 w 53, 3% przypadków raka płaskonabłonkowego sromu. Wszystkie próbki, z wyjątkiem jednej, potwierdzono przez hybrydyzację Southerna przy użyciu specyficznych sond dla wirusa HPV typu 16; PCR i Southern blotting są dopełniającymi się metodami wykrywania brodawczaka HPV. Reakcja łańcuchowa polimerazy jest niezmiernie czuła, reakcja powielania pozwala wykryć nawet pojedynczą kopię DNA wirusa HPV ⁽¹⁵⁾ .

W danych literaturowych nie ma jasnego poglądu na temat zależności między zakażeniem wirusem HPV, a obrazem klinicznym, czy rokowaniem. Hording i wsp. twierdzą, że pacjentki młodsze, ze zmianami patologicznymi sromu związanymi z zakażeniem wirusem HPV, mogą mieć bardziej złośliwe postacie raka, prawdopodobnie z większym ryzykiem wcześniejszych przerzutów ⁽¹⁶⁾ . Natomiast Ansink i wsp. wykazali, że pacjentki z guzami HPV- pozytywnymi mają lepsze rokowanie od chorych z guzami HPV-negatywnymi pti. w tych badaniach, chociaż bez istotności statystycznej, wykazano tendencję do wyższego stosunku wykrywania DNA wirusa HPV w grupie młodszej i we wcześniejszym stadium choroby. Dla określenia znaczenia prognostycznego zarażenia wirusem HPV w raku sromu potrzebne są większe, uzupełniające badania.

Sugerowano, że rak płaskonabłonkowy sromu wydaje się mieć więcej niż jedną przyczynę. Możliwe, że częstym podstawowym mechanizmem jest uwolnienie komórek nabłonkowych sromu spod kontroli p53 przez działanie białka E6 wirusa HPV albo przez mutację genu p53. Chociaż zależność między zmianami genu p53 i zakażeniem wirusem HPV w raku szyjki macicy były szeroko badane, zależności w raku sromu analizowano zaledwie w kilku badaniach. Białko E6 ludzkiego wirusa brodawczaka wiąże się z białkami komórkowymi, szczególnie z białkiem p53, które jest hamującym regulatorem proliferacji komórkowej ⁽¹⁸⁾ . W różnych nowotworach występujących u ludzi, genetyczne zmiany takie, jak mutacje w genie p53, są powszechne. W tych badaniach, analiza immunohistochemiczna wykazała, że w 66, 7% z 15 raków płaskonabłonkowych wystąpiła nadekspresja genu p53, z tendencją do częstszego występowania w grupie pacjentek starszych, w bardziej zaawansowanych stadiach choroby. Potrzebne są duże, dalsze badania dla określenia znaczenia prognostycznego mutacji genu p53 w raku sromu. Wszystkie nowotwory HPV-negatywne wykazywały zmiany w genie p53, w przeciwieństwie do tylko 37, 5% nowotworów HPV-pozytywnych wykazujących takie zmiany. Wykazano znacząca odwrotną zależność między infekcją wirusem HPV i zmianami w genie p53 (p < 0, 05). Wyniki te potwierdzają hipotezę, że rak płaskonabłonkowy sromu może być dzielony na dwie jednostki chorobowe.

Niezgodności między analizą immunohistochemiczna i SSCP mogą być spowodowane czułością SSCP albo fałszywie pozytywnym wynikiem barwienia immunohistochemicznego, występującym w komórkach bez mutacji w genie p53 ^{(19, 20)} . Białko p53 tzw. dzikie ma bardzo krótki okres półtrwania i występuje w niezmiernie małych ilościach, co powoduje, że może być ono niewykrywalne w rutynowym barwieniu immunohistochemicznym. Mutacje punktowe często przedłużają czas półtrwania białka p53 i zwiększająjego ilość powodując, że staje się ono immunohistochemicznie wykrywalne ⁽²¹⁾ . Liczni badacze używają barwienia immunohistochemicznego jako testu skriningowego poprzedzającego sekwencjonowanie. W prezentowanych badaniach wszystkie przypadki mutacji znalezione techniką PCR-SSCP zostały potwierdzone poprzez sekwencjonowanie. Gen p53 zawiera 11 egzonów, ale większość mutacji występuje w obszarach genu, które są wysoce niezmienne w procesie ewolucji i przypuszczalnie mają znaczenie funkcjonalne, głównie w egzonach 5-8 (kodony 126 -306) ⁽²²⁾ . W tych badaniach, wszystkie trzy przypadki mające mutacje w egzonie 7, wykazywały silną pozytywną reakcję w immunohistochemicznym barwieniu p53. Jeden z tych trzech przypadków wykazywał łączne występowanie mutacji w genie p53 i infekcji wirusem HPV. Jest to zgodne z badaniami Lee i wsp. ⁽²³⁾ , którzy proponują dwie hipotezy: (1) komórki mutują w locus p53 i wtedy następuje zarażenie wirusem HPV albo (2) najpierw następuje infekcja wirusem HPV i wtedy dochodzi do punktowej mutacji w genie p53. Wyjaśnienie tych obserwacji wymaga dalszych badań.

Wyniki przedstawianych badań wydają się potwierdzać hipotezy, że zarażenie wirusem HPV oraz zmiany w genie p53 mają istotne znaczenie w rozwoju raka płaskonabłonkowego sromu oraz, że rak płaskonabłonkowy sromu może być traktowany jako dwie różne jednostki chorobowe.

Podziękowania

Autorzy dziękują Youn-Jin Lee za pomoc techniczną.

Piśmiennictwo